Il Laboratorio Cellule Staminali comprende un’attività che abbraccia tre distinti aspetti:

1) Manipolazione prodotti cellulari per uso clinico:

Dal 1991 sono stati realizzati circa 120 trapianti autologhi e più di 580 trapianti di cellule staminali emopoietiche da donatore allogenico nei quali sono inclusi numerosi bambini affetti da immunodeficienze primitive. Il laboratorio realizza procedure di selezione di cellule staminali emopoietiche da donatore compatibile familiare, donatore compatibile da Registro Internazionale e da familiare semicompatibile (uno dei genitori). Nel 1996 è stato realizzato il primo trapianto in utero al mondo e da allora sono stati realizzati  7  trapianti prenatali di cellule staminali in bambini affetti da immunodeficienza combinata grave e da osteogenesi imperfecta.
Il Laboratorio esegue numerose manipolazioni del prodotto cellulare in base sia alla fonte (midollo, cordone o cellule staminali periferiche), sia al tipo di donatore (familiare HLA identico, familiare aploidentico, non familiare HLA identico, autologo) e sia alla patologia del paziente (oncoematologica o deficit immunologico). Per i pazienti pediatrici e adulti che necessitano di terapia cellulare con CAR-T, il Laboratorio coordina la sua attività con l’Unità Clinica del Centro Trapianti Pediatrico e con il Centro Trapianti Adulto, con l’Unità di raccolta aferetica (SIMT) e con la Farmacia Aziendale per poter offrire al paziente le migliori cure disponibili.

L’elenco completo delle prestazioni eseguite si trova nella Guida per l’Utente del Laboratorio Cellule Staminali scaricabile alla fine di questo paragrafo.

2) Diagnostica  molecolare di chimerismo:

Il successo della procedura trapiantologica, accanto ai dati clinici, necessita di conferme di laboratorio che si avvalgono di sofisticate tecnologie molecolari. Il chimerismo donatore-ricevente riconosce quante e quali cellule del donatore sono attecchite nel paziente e quindi danno un’importante informazione al clinico sull’andamento del trapianto. Vengono eseguite analisi molecolari su DNA estratto dalle cellule (derivanti da campioni di sangue periferico, midollare o mucosa boccale) dei pazienti a vari tempi dal trapianto e/o dopo averle separate immunologicamente per analizzare una specifica sottopopolazione cellulare.

Viene eseguita l’Analisi di engraftment materno, cioè la valutazione della presenza di linfociti T circolanti della madre nel bambino, che potrebbero complicare l’attecchimento delle cellule del donatore dopo il trapianto ma che sono anche un parametro diagnostico per alcuni tipi di immunodeficienze primitive.

Viene eseguita l’Analisi di contaminazione materna su villo coriale, esame preliminare alla diagnosi prenatale di malattie congenite; serve per individuare eventuale contaminazione della decidua materna su materiale genetico di origine fetale.

Gli esami di follow up trapiantologico di Chimerismo vengono eseguiti sia per pazienti pediatrici che adulti, mentre l’Analisi di engraftment materno come diagnosi di Immunodeficienza Primitiva solo per pazienti pediatrici, sia per interni che provenienti da altre strutture ospedaliere regionali e nazionali.

Gli esami inerenti l’Analisi di contaminazione materna su villo coriale, vengono eseguiti sia per pazienti interni (Ambulatorio di diagnosi prenatale e Laboratorio di Citogenetica e Genetica Molecolare) sia per interni che provenienti da altre strutture ospedaliere regionali e nazionali.

L’elenco completo delle prestazioni eseguite si trova nella Guida per l’utente del Laboratorio Cellule Staminali scaricabile alla fine di questo paragrafo.

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3) Diagnostica cellulare, enzimatica e molecolare di malattia:

Il Laboratorio rappresenta uno dei pochi Centri in Italia di Riferimento per la diagnosi di malattia granulomatosa cronica (CGD), di Immunodeficienza combinata grave legata a un Deficit di Adenosin Deaminasi (ADA) e di Deficit di Purina Nucleoside Fosforilasi (PNP).

Immunodeficienza combinata grave legata a un Deficit di Adenosin Deaminasi (ADA)

L'immunodeficienza combinata grave (SCID) da deficit di Adenosina deaminasi (ADA) è una forma di SCID caratterizzata da linfopenia marcata e livelli estremamente bassi di tutti gli isotipi delle immunoglobuline, che causano gravi infezioni opportunistiche ricorrenti.
La SCID da deficit di ADA rappresenta il 15% di tutti i casi di SCID. La sua incidenza annuale è stimata tra 1/200.000 e 1/1.000.000 nati vivi. I due sessi sono colpiti in eguale misura.
La SCID da deficit di ADA ha un quadro clinico variabile. La forma più comune esordisce nel periodo neonatale con infezioni opportunistiche gravi e ricorrenti (comprese le infezioni delle vie respiratorie e la candidiasi), il ritardo della crescita e, di solito, esita nella morte precoce.
I pazienti possono presentare, inoltre, sintomi extraimmunologici (compresi i deficit dello sviluppo neurologico, i disturbi comportamentali, la sordità neurosensoriale e le anomalie scheletriche ed epatiche),in conseguenza dell'espressione sistemica dell'ADA.
La SCID da deficit di ADA è causata dalle mutazioni del gene ADA (20q13.11). La trasmissione è autosomica recessiva.
Il trattamento si basa sul trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT), la terapia sostitutiva enzimatica con l'enzima adenosina deaminasi pegilato (Peg-ADA) o la terapia genica con infusione di cellule CD34+ midollari, trasdotte con un vettore contenente ADA.
Per saperne di più visita il sito : http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php?lng=IT

 
INQUADRAMENTO DIAGNOSTICO EFFETTUATO DAL LABORATORIO:

La diagnosi si basa sull'evidenza della diminuzione o dell'assenza dell'attività della ADA negli eritrociti, associata ad una marcata diminuzione dei livelli dei linfociti T, B e NK, rispetto a quelli presenti nei coetanei non affetti. La diagnosi può essere confermata dall'aumento dei livelli di metaboliti della Purina (dATP), negli eritrociti. I tests cellulari, in caso di positività, vengono confermati dalla diagnosi molecolare.

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Scarica la Modalità invio prelievo Dosaggio enzimatico di Adenosin Deaminasi (ADA) nel plasma
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Deficit di Purina Nucleoside Fosforilasi (PNP)

Il deficit di Purina Nucleoside Fosforilasi, a trasmissione autosomica recessiva, inibisce il catabolismo dell'inosina a ipoxantina e della guanosina a guanina, dando luogo all'accumulo di guanosina, inosina e dei loro deossi-derivati e alla diminuzione dei livelli di guanina, così come di ipoxantina, xantina e acido urico. La malattia si manifesta essenzialmente con infezioni recidivanti, che compaiono alla fine del primo anno di vita e che evolvono nel corso dei primi 5-6 anni. I pazienti sono particolarmente sensibili alle infezioni virali come la varicella, la parotite, il citomegalovirus, ma 1/3 dei pazienti presenta anche infezioni batteriche suppurative e anemia mentre 2/3 soffrono di disturbi neurologici, come l'atassia, la tetraparesi spastica e i tremori. La trasmissione è autosomica recessiva.
Si tratta di una malattia ad evoluzione spontaneamente grave. Oltre al trattamento sintomatico e alla prevenzione delle infezioni, la terapia consiste nel trapianto del midollo e nelle trasfusioni continue di sangue irradiato.
Per saperne di più visita il sito : http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php?lng=IT

INQUADRAMENTO DIAGNOSTICO EFFETTUATO DAL LABORATORIO:

La diagnosi è sospettata in base al deficit funzionale dei linfociti T, associato ad ipouricemia grave e viene confermata con il dosaggio dell'enzima sugli eritrociti. E' presente una grave immunodeficienza, caratterizzata dalla marcata riduzione dei linfociti T. La diagnosi con test cellulare viene confermata dall’analisi molecolare del gene malattia.
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Scarica la Modalità invio prelievo dosaggio enzimatico PNP
Scarica la Modalità invio prelievo Diagnosi Molecolare PNP Deficit
Scarica il Modulo richiesta prelievi per Strutture  esterne
Scarica il Modulo modsda2906 consenso informato analisi genetiche  

Scarica la Modalità invio prelievo Diagnosi Molecolare PNP in familiari-test mirato

                        
Malattia Granulomatosa Cronica (CGD)

La Malattia Granulomatosa Cronica rappresenta un raro gruppo di alterazioni genetiche ereditarie che colpiscono il sistema immunitario, rendendolo incapace a distruggere microorganismi patogeni. È causata da un difetto nel complesso della NADPH ossidasi, produttrice di radicali liberi dell'ossigeno, che predispone i pazienti a ricorrenti infezioni e malattie autoimmuni. La malattia interessa circa 1 ogni 500.000 persone.
La trasmissione nella maggior parte dei casi (65%) è legata al cromosoma X ( gene CYBB). I rimanenti casi di CGD sono legati ad una trasmissione autosomica recessiva (AR-CGD); questi pazienti presentano un quadro clinico meno aggressivo rispetto al CGD-  X-linked. I geni coinvolti in AR-CGD sono : NCF1, CYBA, NCF2, NCF4.
La terapia consiste essenzialmente nella prevenzione delle infezioni batteriche e fungine mediante l'uso di antibiotici e antifungini. In alcuni casi, può essere proposto un allotrapianto di cellule staminali emopoietiche.
Per saperne di più visita il sito : http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php?lng=IT

INQUADRAMENTO DIAGNOSTICO EFFETTUATO DAL LABORATORIO:

La diagnosi cellulare di CGD avviene con due metodi, stimolando in vitro e colorando i granulociti neutrofili con colorazioni vitali specifiche che evidenziano la capacità o meno degli stessi a fagocitare e distruggere germi e microorganismi, e mediante analisi citofluorimetrica. La diagnosi molecolare X-linked (ricerca di mutazioni a carico della regione codificante del gene CYBB) o autosomica recessiva (ricerca di mutazioni a carico della regione codificante dei geni NCF1, CYBA, NCF2, NCF4) di Malattia Granulomatosa Cronica conferma la diagnosi cellulare.

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Scarica la Modalità invio prelievo DHR123

Scarica la Modalità invio prelievo NBT test
Scarica la Modalità invio prelievo Diagnosi Molecolare CGD
Scarica il Modulo richiesta prelievi per Strutture  esterne
Scarica il Modulo modsda2906 consenso informato analisi genetiche    

Scarica la Modalità invio prelievo Diagnosi molecolare di CGD in familiari-test mirato

Valutazione della funzionalità granulocitaria

La valutazione del processo di chemiotassi, che prevede l’esecuzione del test Migratest, permette la determinazione qualitativa della mobilità dei polimorfonucleati (PMN). La misurazione avviene mediante citofluorimetria a flusso; il processo di chemiotassi, infatti, prevede la perdita di espressione della molecola di adesione cellulare L-selectina, che viene rilevata mediante legame con anticorpo anti-L-selectina.

La valutazione del processo di fagocitosi prevede l’esecuzione del test Phagotest. Esso permette la determinazione quantitativa della fagocitosi leucocitaria, misurando la percentuale complessiva di monociti e granulociti che mostrano fagocitosi cioè ingestione di uno o più batteri per cellula. La misurazione avviene mediante citofluorimetria a flusso; il processo di fagocitosi, infatti, prevede l’ingestione dei batteri marcati con fluoresceina da parte delle cellule che hanno attivato il processo di fagocitosi.

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Malattie ematologiche, aplasia midollare, anemia aplastica grave e Sindrome di Kostmann

Il Laboratorio esegue tests di funzionalità cellulare come la capacità di proliferazione e maturazione delle cellule midollari in pazienti con malattie ematologiche ed aplasie midollari (colonie di precursori emopoietici CFU-GEMM; CFU-GM; BFU-E).

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Il Laboratorio si impegna quotidianamente a proporre nuove attività e progetti per il miglioramento continuo del centro, in quanto, essendo una realtà che svolge un’attività istituzionale di estrema specificità, sia da un punto di vista normativo per le certificazioni in atto che da un punto di vista professionale, ha il compito di mantenere un aggiornamento costante al passo con i centri equivalenti nazionali e internazionali.

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Il Laboratorio Cellule Staminali fa parte della S.C. Laboratorio Centrale Analisi Chimico Cliniche.

Le attività del Laboratorio Cellule Staminali, che hanno avuto inizio nel 1991 presso gli Spedali Civili di Brescia, hanno sede presso i locali individuati al primo piano della Palazzina AIL (“Centro di ricerca AIL”) sono certificate secondo il Sistema Qualità ISO 9001:2015 e accreditate secondo gli Standard JACIE (Joint Accreditation Committee of ISCT and EBMT) dal novembre 2013, accreditamento di qualificazione di eccellenza dei Centri Trapianto Europei. Inoltre é certificato EFI per quanto riguarda lo studio del follow-up di chimerismo post trapianto.

Il Laboratorio dispone di ambienti dedicati e con caratteristiche adeguate alle Direttive Europee per la manipolazione e la preparazione delle cellule staminali per la realizzazione del trapianto e per il congelamento delle cellule midollari e periferiche nel trapianto autologo o allogenico.

Per quanto riguarda l’attività strettamente legata alla manipolazione per trapianto il Laboratorio lavora in collaborazione con il reparto Clinici di trapianto midollo osseo adulti e il reparto di Oncoematologia Pediatrica e Trapianto di Midollo Osseo che è centro regionale di riferimento, assieme a Pavia e Monza, per l’Associazione Italiana di Ematologia ed Oncologia Pediatrica (AIEOP) nel trattamento delle leucemie e patologie oncoematologiche ed è centro di riferimento nazionale nel trattamento di pazienti affetti da immunodeficienze primitive e patologie genetiche per l’EBMT (European Group for Blood and Marrow Transplantation).

Accanto all’attività di manipolazione per trapianto, il Laboratorio esegue tests diagnostici nella fase di esordio della malattia, nella fase pre e post trapianto di cellule staminali sia per pazienti pediatrici che adulti, sia per interni che esterni che provenienti da altre strutture ospedaliere.
         
Il Laboratorio opera principalmente nei seguenti locali:

• uno, sede di accettazione campioni uno, sede di segreteria e refertazione amministrativa;
• uno, sede di accettazione campioni;
• uno, sede di accettazione campioni uno, sede di preparazione, manipolazione, separazione di cellule staminali emopoietiche per la realizzazione del trapianto allogenico;
• uno, sede di preparazione, manipolazione, crioconservazione di cellule staminali emopoietiche autologhe e criopreservazione di cellule staminali allogeniche;
• uno, sede di controlli di qualità del prodotto cellulare destinato al trapianto;
• uno, sede di diagnostica relativa alla diagnosi di malattia (oncoemopatie, immunodeficienze), accertamenti pre e post trapianto per la valutazione ed il monitoraggio del successo clinico delle procedure terapeutiche;
• un locale di stoccaggio per la crioconservazione delle sacche di cellule staminali (Sala criogenica AIL), situato al piano terra della Palazzina AIL
• un locale di stoccaggio per la crioconservazione delle sacche di cellule staminali (Sala criogenica ABE), situato c/o il Laboratorio di Medicina Molecolare Angelo Nocivelli;
• quattro differenti postazioni nei locali situati al piano terra della Palazzina AIL e dedicati alle varie fasi di diagnostica molecolare;.