Il Laboratorio Cellule Staminali comprende un’attività che abbraccia tre distinti aspetti:

1) Manipolazione cellule staminali per uso clinico:

Dal 1991 sono stati realizzati circa 130 trapianti autologhi e più di  470 trapianti di midollo osseo da donatore allogenico nei quali sono inclusi numerosi  bambini affetti da immunodeficienze primitive. Il laboratorio realizza procedure di selezione di cellule staminali da donatore compatibile familiare, donatore compatibile da Registro Internazionale e da familiare semicompatibile (uno dei genitori). Nel 1996 è stato realizzato il primo trapianto in utero al mondo e da allora sono stati realizzati  7  trapianti prenatali di cellule staminali in bambini affetti da immunodeficienza combinata grave e da osteogenesi imperfecta.
Viene inoltre effettuato il monitoraggio e la numerazione delle cellule staminali CD34+ in corso di mobilizzazione con fattori di crescita in pazienti e/o donatori che verranno sottoposti a raccolta aferetica.

Il Laboratorio ha in esecuzione una nuova procedura di manipolazione, la Deplezione dei linfociti TCR α/β+ e CD19+ destinati al trapianto. Questo approccio si basa sulla sola eliminazione, dal graft (prodotto cellulare destinato al trapianto), delle cellule effettrici della GvHD (malattia del Trapianto verso l’Ospite), ovvero i linfociti T αβ, mantenendo al contempo nell’inoculo altre popolazioni cellulari utili ai fini dell’outcome trapiantologico (principalmente cellule NK, linfociti Tγδ e, in misura minore, cellule dendritiche). Dato che tali cellule sono funzionalmente mature, esse possono esplicare il loro effetto benefico immediatamente dopo il trapianto (cosa che non succede nel trapianto “convenzionale” T-depleto, in cui la maturazione delle cellule NK richiede dalle 6 alle 8 settimane di tempo). Tale tecnica è stata resa possibile dallo sviluppo di una metodica per la deplezione dei linfociti TcRαβ+ e CD19+ da cellule mononucleate (PBMCs) mobilizzate, utilizzabile a livello clinico. (Tubingen: Handgretinger et al., 2011, Bertaina et al., 2013).

Prestazioni riguardanti la manipolazione CSE per trapianto (solo per utenti interni):

• 15014- Deplezione plasma (per incompatibilità minore)
• 15015- Deplezione globuli rossi (per incompatibilità maggiore)
• 15016- Selezione positiva di cellule CD34+
• 15017- Crioconservazione di cellule staminali midollari
• 15018- Crioconservazione di cellule staminali periferiche
• 15021- Scongelamento e lavaggio di cellule staminali midollari criopreservate
• 15033- Scongelamento e lavaggio di cellule staminali cordonali criopreservate
• 15034- Scongelamento e lavaggio di cellule staminali periferiche criopreservate
• 15020- Criopreservazione di sospensioni linfocitarie
• 15052- Scongelamento sospensioni cellulari
• 15053- Deplezione TcR alfa/beta e CD19+
• 15035- Riduzione volume

 
Prestazioni riguardanti la manipolazione CSE per trapianto (sia per utenti interni che esterni):

• 3280- Numerazione cellule CD34+
 

2) Analisi molecolare di chimerismo:

Il successo della procedura trapiantologica, accanto ai dati clinici, necessita di conferme di laboratorio che si avvalgono di sofisticate tecnologie molecolari. Il chimerismo donatore-ricevente riconosce quante e quali cellule del donatore sono attecchite e quindi danno un’importante informazione al clinico sull’andamento del trapianto. Vengono eseguite analisi molecolari su DNA estratto dalle cellule (derivanti da campioni di sangue periferico o midollare) dei pazienti a vari tempi dal trapianto e dopo averle separate immunologicamente per analizzare una specifica sottopopolazione cellulare.

Prestazioni riguardanti il chimerismo:

• 5008- Analisi quantitativa di chimerismo su linfociti totali (PBL)
• 5013- Analisi quantitativa di chimerismo su Polimorfonucleati (PMN)
• 5009- Analisi quantitativa di chimerismo su T linfociti (CD3+)
• 5010- Analisi quantitativa di chimerismo su B linfociti (CD19+)
• 5012- Analisi quantitativa di chimerismo su Natural Killer (CD56+)
• 5011- Analisi quantitativa di chimerismo su Monociti (CD14+)
• 5027- Analisi quantitativa di chimerismo su Cellule Staminali (CD34+) da sangue midollare
• 5028-Analisi quantitativa di chimerismo su linfociti totali (MNC) da sangue midollare
• 5013-Analisi quantitativa di chimerismo su Polimorfonucleati (PMN) da sangue midollare
• 5027bis-Analisi Quantitativa di Chimerismo su mucosa boccale
• 5029-Analisi Quantitativa di Chimerismo su Cellule staminali CD34-(CD34-)
• 5022- Analisi di engraftment materno

 
L’analisi di engraftment materno analizza la presenza di linfociti T circolanti della madre nel bambino che potrebbero complicare l’attecchimento delle cellule del donatore in caso di trapianto, ma dirimente anche per la diagnostica di SCID (Immunodeficienza Combinata Grave).

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3) Diagnostica cellulare, enzimatica e molecolare di malattia:

Il Laboratorio rappresenta uno dei pochi Centri in Italia di Riferimento per la diagnosi di malattia granulomatosa cronica (CGD) , di Immunodeficienza combinata grave legata a un Deficit di  Adenosin Deaminasi (ADA) e di Deficit di Purina Nucleoside Fosforilasi (PNP).

Immunodeficienza combinata grave legata a un Deficit di  Adenosin Deaminasi (ADA)

L'immunodeficienza combinata grave (SCID) da deficit di adenosina deaminasi (ADA) è una forma di SCID caratterizzata da linfopenia marcata e livelli estremamente bassi di tutti gli isotipi delle immunoglobuline, che causano gravi infezioni opportunistiche ricorrenti.
La SCID da deficit di ADA rappresenta il 15% di tutti i casi di SCID. La sua incidenza annuale è stimata tra 1/200.000 e 1/1.000.000 nati vivi. I due sessi sono colpiti in eguale misura.
La SCID da deficit di ADA ha un quadro clinico variabile. La forma più comune esordisce nel periodo neonatale con infezioni opportunistiche gravi e ricorrenti (comprese le infezioni delle vie respiratorie e la candidiasi), il ritardo della crescita e, di solito, esita nella morte precoce.
I pazienti possono presentare, inoltre, sintomi extraimmunologici (compresi i deficit dello sviluppo neurologico, i disturbi comportamentali, la sordità neurosensoriale e le anomalie scheletriche ed epatiche),in conseguenza dell'espressione sistemica dell'ADA.
La SCID da deficit di ADA è causata dalle mutazioni del gene ADA (20q13.11). La trasmissione è autosomica recessiva.
Il trattamento si basa sul trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT), la terapia sostitutiva enzimatica con l'enzima adenosina deaminasi pegilato (Peg-ADA) o la terapia genica con infusione di cellule CD34+ midollari, trasdotte con un vettore contenente ADA.
Per saperne di più visita il sito : http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php?lng=IT

 
INQUADRAMENTO DIAGNOSTICO EFFETTUATO DAL LABORATORIO:

La diagnosi si basa sull'evidenza della diminuzione o dell'assenza dell'attività della ADA negli eritrociti, associata ad una marcata diminuzione dei livelli dei linfociti T, B e NK, rispetto a quelli presenti nei coetanei non affetti. La diagnosi può essere confermata dall'aumento dei livelli di metaboliti della Purina (dATP), negli eritrociti. I tests cellulari , in caso di positività,vengono confermati dalla diagnosi molecolare.

Prestazioni riguardanti la diagnosi di Deficit di Adenosi Deaminasi:

• 1104- Dosaggio enzimatico di Adenosin Deaminasi
• 5001- Diagnosi molecolare di deficit di ADA
• 5031- Diagnosi molecolare Stato di deficit di ADA in familiari – test mirato
• 5023- Dosaggio dei Nucleotidi di Adenosina e desossiAdenosina

In corso di terapia enzimatica sostitutiva con Peg-ADA vengono eseguiti inoltre:

• 5030- Dosaggio enzimatico di Adenosin Deaminasi (ADA) nel plasma
• 5032- Ricerca Anticorpi anti-ADA nel plasma

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Deficit di Purina Nucleoside Fosforilasi (PNP)

Il deficit di Purina Nucleoside Fosforilasi, a trasmissione autosomica recessiva, inibisce il catabolismo dell'inosina a ipoxantina e della guanosina a guanina, dando luogo all'accumulo di guanosina, inosina e dei loro deossi-derivati e alla diminuzione dei livelli di guanina, così come di ipoxantina, xantina e acido urico. La malattia si manifesta essenzialmente con infezioni recidivanti, che compaiono alla fine del primo anno di vita e che evolvono nel corso dei primi 5/6 anni. I pazienti sono particolarmente sensibili alle infezioni virali come la varicella, la parotite, il citomegalovirus, ma 1/3 dei pazienti presenta anche infezioni batteriche suppurative e anemia mentre 2/3 soffrono di disturbi neurologici, come l'atassia, la tetraparesi spastica e i tremori. La trasmissione è autosomica recessiva.
Si tratta di una malattia ad evoluzione spontaneamente grave. Oltre al trattamento sintomatico e alla prevenzione delle infezioni, la terapia consiste nel trapianto del midollo e nelle trasfusioni continue di sangue irradiato.
Per saperne di più visita il sito : http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php?lng=IT

INQUADRAMENTO DIAGNOSTICO EFFETTUATO DAL LABORATORIO:

La diagnosi è sospettata in base al deficit funzionale dei linfociti T, associato ad ipouricemia grave e viene confermata con il dosaggio dell'enzima sugli eritrociti. E' presente una grave immunodeficienza, caratterizzata dalla marcata riduzione dei linfociti T. La diagnosi con test cellulare viene confermata dall’analisi molecolare del gene malattia.

Prestazioni riguardanti la diagnosi di Deficit di Purin Nucleoside Fosforilasi:

• 1105- Dosaggio enzimatico di Purin Nucleoside Fosforilasi
• 5040- Diagnosi molecolare di deficit di PNP
• 5041- Diagnosi molecolare Stato di deficit di PNP in familiari – test mirato

 
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Malattia Granulomatosa Cronica (CGD)

La Malattia Granulomatosa Cronica rappresenta un raro gruppo di alterazioni genetiche ereditarie che colpiscono il sistema immunitario, rendendolo incapace a  distruggere microorganismi patogeni. È causata da un difetto nel complesso della NADPH ossidasi, produttrice di radicali liberi dell'ossigeno, che predispone i pazienti a ricorrenti infezioni e malattie autoimmuni. La malattia interessa circa 1 ogni 500.000 persone.
La trasmissione nella maggior parte dei casi (65%) è legata al cromosoma X ( gene CYBB). I rimanenti casi di CGD sono legati ad una trasmissione autosomica recessiva (AR-CGD); questi pazienti presentano un quadro clinico meno aggressivo rispetto al CGD-  X-linked. I geni coinvolti in AR-CGD sono : NCF1, CYBA, NCF2, NCF4.
La terapia consiste essenzialmente nella prevenzione delle infezioni batteriche e fungine mediante l'uso di antibiotici e antifungini. In alcuni casi, può essere proposto un allotrapianto di cellule staminali emopoietiche.
Per saperne di più visita il sito : http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php?lng=IT

INQUADRAMENTO DIAGNOSTICO EFFETTUATO DAL LABORATORIO:

La diagnosi cellulare di CGD  avviene con due metodi, stimolando in vitro e colorando i granulociti neutrofili con colorazioni vitali specifiche che evidenziano la capacità o meno degli stessi a fagocitare e distruggere germi e microorganismi, e mediante analisi citofluorimetrica. La diagnosi molecolare X-linked (ricerca di mutazioni a carico della regione codificante del gene CYBB) o autosomica recessiva (ricerca di mutazioni a carico della regione codificante dei geni NCF1, CYBA, NCF2, NCF4) di Malattia Granulomatosa Cronica  conferma la diagnosi cellulare.

Prestazioni riguardanti la diagnosi di Malattia Granulomatosa Cronica:

• 1188- Test Diidrorodamina 123 (DHR 123)
• 1102- NBT Test (NitroblueTetrazolium test)
• 5051- Diagnosi molecolare di CGD
• 5050- Diagnosi molecolare di CGD in familiari – test mirato

 
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Malattie ematologiche, aplasia midollare, anemia aplastica grave e Sindrome di Kostmann

Il Laboratorio esegue  tests di funzionalità cellulare come la capacità di proliferazione e maturazione delle cellule midollari in pazienti con malattie ematologiche ed aplasie midollari (colonie di precursori emopoietici CFU-GEMM; CFU-GM; BFU-E).

Prestazioni riguardanti l’analisi di funzionalità cellulare:

• 1122- Coltura semisolida di precursori emopoietici (CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E)

Il Laboratorio si impegna quotidianamente a proporre nuove attività e progetti per il miglioramento continuo del centro, in quanto, essendo una realtà che svolge un’attività istituzionale di estrema specificità, sia da un punto di vista normativo per le certificazioni in atto che da un punto di vista professionale, ha il compito di mantenere un aggiornamento costante al passo con i centri equivalenti nazionali e internazionali.

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Il Laboratorio Cellule Staminali, Sezione di Ematologia e Coagulazione, fa parte della U.O Laboratorio Analisi Chimico Cliniche.

Le attività del Laboratorio Cellule Staminali, che hanno avuto inizio nel 1991 presso gli Spedali Civili di Brescia, hanno sede presso i locali individuati al primo piano della Palazzina AIL (“Centro di ricerca AIL”) sono certificate secondo il Sistema Qualità ISO 9001:2008 e accreditate secondo gli Standard JACIE (Joint Accreditation Committee of ISCT and EBMT) dal novembre 2013, accreditamento di qualificazione di eccellenza dei Centri Trapianto Europei.

Il Laboratorio Cellule Staminali effettua procedure di manipolazione cellulare che consentono di realizzare trapianti allogenici di cellule staminali, da donatore familiare, da banca internazionale e da donatore semicompatibile , oltre alle altre manipolazioni di preparazione e crioconservazione che riguardano il trapianto autologo, in bambini affetti da oncoemopatie (leucemie e tumori solidi) e malattie genetiche dell’immunità.

Dispone di un ambiente dedicato e con caratteristiche adeguate alle Direttive Europee per la manipolazione e la preparazione delle cellule staminali per la realizzazione del trapianto e per il congelamento delle cellule midollari e periferiche nel trapianto autologo o allogenico.

Per quanto riguarda l’attività strettamente legata alla manipolazione per trapianto il Laboratorio lavora in collaborazione con il reparto di Oncoematologia Pediatrica e Trapianto di Midollo Osseo che è centro regionale di riferimento, assieme a Pavia e Monza, per l’Associazione Italiana di Ematologia ed Oncologia Pediatrica (AIEOP) nel trattamento delle leucemie e patologie oncoematologiche ed è centro di riferimento nazionale nel trattamento di pazienti affetti da immunodeficienze primitive e patologie genetiche per l’EBMT (European Group for Blood and Marrow Transplantation).

Accanto all’attività di manipolazione per trapianto, il Laboratorio esegue tests diagnostici nella fase di esordio della malattia, nella fase pre e post trapianto di cellule staminali sia per pazienti pediatrici che adulti, sia per interni che esterni che provenienti da altre strutture ospedaliere.
         
Il Laboratorio opera principalmente nei seguenti locali:

• uno, sede di accettazione e refertazione amministrativa;
• uno, sede di preparazione, manipolazione, separazione di cellule staminali emopoietiche per la realizzazione del trapianto allogenico;
• uno, sede di preparazione, manipolazione, crioconservazione di cellule staminali emopoietiche autologhe e criopreservazione di cellule staminali allogeniche;
• uno, sede di controlli di qualità del prodotto cellulare destinato al trapianto;
• uno, sede di diagnostica relativa alla diagnosi di malattia (oncoemopatie, immunodeficienze), accertamenti pre e post trapianto per la valutazione ed il monitoraggio del successo clinico delle procedure terapeutiche;
• un locale di stoccaggio per la crioconservazione delle sacche di cellule staminali (Sala criogenica AIL), situato al piano terra della Palazzina AIL
• un locale di stoccaggio per la crioconservazione delle sacche di cellule staminali (Sala criogenica ABE), situato c/o il Laboratorio di Medicina Molecolare Angelo Nocivelli;
• quattro differenti postazioni nei locali situati al piano terra della Palazzina AIL e dedicati alle varie fasi di diagnostica molecolare;
• uno, sede di ricezione campioni per diagnostica.